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天然的抗氧化活性物质主要包括黄酮类、多酚类、维生素类和多糖等,真菌产生的抗氧化活性物质则主要有醌类、酚类、多糖类、三萜类、对联三苯类等。苯醌是结构最简单的醌类化合物,广泛存在于生物体内,主要包括对苯醌和邻苯醌两大类,而天然存在的苯醌化合物多为对苯醌及其衍生物。苯醌由于其特殊的分子结构,可以参与生物系统中电子和质子的转移过程,具有作为抗氧化剂的潜力。

Xu Qiao等最先从瓶生顶孢霉(Acremonium cavaraeanum)CA022菌株固体发酵中提取分离和鉴定出双对苯醌(DTXT)(图1),这是一种新的苯醌化合物,因而,其生物活性尚未被研究和揭示,并且前期发酵研究获得的DTXT产量也比较低,都将限制其未来可能的应用。南京师范大学生命科学学院的胡彦丽、潘利利、陈双林*等借鉴已知苯醌类化合物具有抗氧化活性的线索,首先探索瓶生顶孢霉CA022菌株固体发酵所产生的DTXT的抗氧化活性。在证明DTXT具有良好抗氧化活性的基础上,通过单因素试验和响应面试验优化固体发酵条件提高其产量。

1、DTXT的提取和纯化

将获得含目标产物的晶体通过HPLC检测,得到检测图谱(图2)。在相同的检测条件下,待测样品中主要物质的出峰时间为6.538 min(图2A),与本实验室保存的纯化对照品出峰时间6.556 min(图2B)基本一致,并且待测样品的纯度达到98%,纯度较高,可以为后续实验使用。

2、DTXT体外抗氧化活性

DTXT还原力

还原力反映了抗氧化物质的总抗氧化能力。DTXT还原力随着质量浓度的提高而增强(表2),当DTXT质量浓度为200 µg/mL时,吸光度为0.608±0.002。在150~200 µg/mL质量浓度范围内,DTXT吸光度较大,与芦丁相当,差异不显著。在20~200 µg/mL范围内,DTXT还原力均显著低于相同质量浓度下的VC,但显著高于相同质量浓度的VE和BHT。结果表明DTXT具有良好的总抗氧化能力。

DTXT对超氧阴离子自由基的清除作用

不同质量浓度的DTXT均能清除超氧阴离子自由基,在20~200 µg/mL范围内,清除能力随着DTXT质量浓度的提高而增强(表3),IC50为112.70 μg/mL。在200 µg/mL质量浓度下,DTXT对超氧阴离子自由基清除率达到(67.00±5.05)%。在150 µg/mL和200 µg/mL质量浓度下,DTXT对超氧阴离子自由基清除率显著高于BHT。在20~200 µg/mL范围内,DTXT清除超氧阴离子自由基的能力与VE大体相当,但低于相同质量浓度的VC和芦丁,且差异显著。

DTXT对羟自由基的清除作用

DTXT对羟自由基具有良好的清除作用,清除能力随着DTXT质量浓度的提高而增强(表4),IC50为78.63 μg/mL。在200 µg/mL时,DTXT对羟自由基清除率为(78.83±3.19)%。在20~200 µg/mL范围内,DTXT对羟自由基清除率均显著高于相同质量浓度的VE和BHT,但低于相同质量浓度的VC。在高质量浓度(150~200 µg/mL)时,与芦丁的清除作用差异不显著。

DTXT对DPPH自由基的清除作用

DTXT对DPPH自由基也具有良好的清除作用(表5),清除能力随着DTXT质量浓度的提高而增强,IC50为88.36 μg/mL。在质量浓度为200 µg/mL时,对DPPH自由基清除率达到(76.53±3.08)%。在较高质量浓度(150 µg/mL和200 µg/mL)下,DTXT对DPPH自由基清除率显著高于相同质量浓度的BHT和VE,低于相同浓度的芦丁,但无显著差异。在20~200 µg/mL范围内,DTXT对DPPH自由基清除率均显著低于相同质量浓度的VC。

3、DTXT的固体发酵

DTXT产量曲线

DTXT产量随着供试菌株瓶生顶孢霉CA022固体发酵培养时间的延长不断增加(图3),在固体发酵14 d达到最大(2 815.89 mg/kg),之后,产量逐步下降,因此将DTXT的固体发酵时间确定为14 d。

碳源对固体发酵产DTXT产量的影响

向瓶生顶孢霉CA022菌株固体发酵培养基中分别添加6 种供试碳源(葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、乳糖和可溶性淀粉),图4结果表明,它们均可被CA022菌株利用,并且提高了DTXT产量。随着碳源质量分数的增加,DTXT产量在较低质量分数下都在逐渐增加,在较高质量分数下则逐渐下降。DTXT产量达到最高时的各碳源处理质量分数不同,葡萄糖质量分数为1.0%时,DTXT产量达到2 864.83 mg/kg;蔗糖质量分数为1.25%时,DTXT产量达到1 564.15 mg/kg;麦芽糖质量分数为1.25%时,DTXT产量达到 2 693.61 mg/kg;果糖质量分数为1.25%时,DTXT产量达到2 024.51 mg/kg;乳糖质量分数为1.25%时,DTXT产量达到2 210.11 mg/kg;可溶性淀粉质量分数为1.0%时,DTXT产量达到2 349.49 mg/kg。相比于另外5 种碳源,葡萄糖在较低质量分数时,DTXT产量就达到最高,且高于其他5 种碳源处理的最高产量。

氮源对固体发酵产DTXT产量的影响

向瓶生顶孢霉CA022菌株固体发酵培养基中分别添加6 种供试氮源(硝酸钠、硝酸钾、氯化铵、硫酸铵、尿素和蛋白胨),图5结果表明,它们均可被CA022菌株利用,并且提高了DTXT产量。随着氮源质量分数的增加,DTXT产量在较低质量分数下都在逐渐增加,在较高质量分数下则逐渐下降。DTXT产量达到最高时的各氮源处理质量分数不同,硝酸钠质量分数为0.175%时,DTXT产量达到2 837.97 mg/kg;硝酸钾质量分数为0.175%时,DTXT产量达到2 444.31 mg/kg;氯化铵质量分数为0.175%时,DTXT产量达到992.47 mg/kg;硫酸铵质量分数为0.15%时,DTXT产量达到864.27 mg/kg;尿素质量分数为0.15%时,DTXT产量达到700.06 mg/kg;蛋白胨质量分数为0.175%时,DTXT产量达到643.24 mg/kg。相比于另外5 种氮源,添加0.175%硝酸钠时,DTXT产量最高,且显著高于其他5 种氮源处理的最高产量(P<0.05)。

微量元素对固体发酵产DTXT产量的影响

向瓶生顶孢霉CA022菌株固体发酵培养基中分别添加5 种微量元素(MgSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、MnSO4·7H2O和H3BO3),图6结果表明,它们均可被CA022菌株利用,并且提高了DTXT产量。随着微量元素质量分数的升高,DTXT产量在较低质量分数下都在逐渐增加,在较高质量分数下则逐渐下降。DTXT达到最高时的各微量元素处理质量分数不同,MgSO4质量分数为0.03%时,DTXT产量达到2 558.55 mg/kg;ZnSO4质量分数为0.03%时,DTXT产量达到1 452.88 mg/kg;FeSO4质量分数为0.025%时,DTXT产量达到572.50 mg/kg;MnSO4质量分数为0.025%时,DTXT产量达到727.36 mg/kg;H3BO3质量分数为0.03%时,DTXT产量达到2 831.37 mg/kg。相比于另外5 种微量元素,H3BO3效果最佳,质量分数为0.03%时,DTXT产量最高,且显著高于其他4 种供试微量元素处理的最高产量(P<0.05)。

维生素对固体发酵产DTXT产量的影响

向瓶生顶孢霉CA022菌株固体发酵培养基中分别添加6 种B族维生素——硫胺素(VB1)、核黄素(VB2)、烟酸(VB3)、吡哆素(VB6)、生物素(VB7)和钴胺素(VB12),结果表明(图7),与不添加任何维生素的处理相比,它们在一定程度上均可提高固体发酵DTXT产量,但差异不显著。其中VB1的效果最好,含量为75 μg/100 g时,DTXT产量最高,达到4 254.90 mg/kg。

响应面试验结果

根据单因素试验结果,分别选择葡萄糖、硝酸钠、H3BO3和VB1作为瓶生顶孢霉CA022菌株固态发酵产DTXT的组合处理,利用Design-Expert 12.0进行中心组合试验设计,共30 组,所得结果如表6所示。

由回归模型方差分析(表7)可以看出,响应模型的P<0.000 1,F=75.65,失拟项P=0.228 6>0.05不显著,表明该模型拟合度较高。此外,模型的相关系数R2为0.986 0,说明该模型可以解释98.60%的响应值变化,只有很小的变量(1.40%)没有得到合理的解释,表明预测结果与实际结果的一致性较好。

由图8可以看出,各因素交互作用大小依次为:葡萄糖与H3BO3>硝酸钠与VB1>葡萄糖与硝酸钠>硝酸钠与H3BO3>葡萄糖与VB1>H3BO3与VB1,与表7回归分析结果相符。

通过Design-Expert 12.0软件,预测得到瓶生顶孢霉CA022菌株发酵产DTXT的最优组合为葡萄糖0.773%、硝酸钠0.185%、H3BO3 0.032%、VB1 100 μg/100 g,预测得到的DTXT最大产量为4 016.24 mg/kg。在模型预测最优组合条件下进行发酵,实际得到的DTXT产量为4 150.80 mg/kg。实验值与理论值在合理的误差范围内,证明该优化方案可行,可用于DTXT的生产。

结 论

通过体外抗氧化实验考察了DTXT的抗氧化活性,通过优化瓶生顶孢霉CA022菌株的培养基配方,提高了DTXT产量。体外抗氧化实验结果表明,DTXT还原能力以及对DPPH自由基和羟自由基的清除能力与芦丁大体相当,具有作为抗氧化剂的潜力。响应面试验结果表明,优化后的DTXT产量(4 150.80 mg/kg)是优化前(2 864.83 mg/kg)的1.45 倍,为DTXT固体发酵的研发提供了理论依据。

本文《双对苯醌的抗氧化活性分析及其固体发酵条件优化》来源于《食品科学》2022年43卷14期199-207页,作者:胡彦丽,潘利利,闫淑珍,陈双林。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20210724-289。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

修改/编辑:袁艺;责任编辑:张睿梅

图片来源于文章原文及摄图网。

为进一步促进动物源食品科学的发展,带动产业的技术创新,更好的保障人类身体健康和提高生活品质,北京食品科学研究院和中国食品杂志社在宁波和西宁成功召开前两届“动物源食品科学与人类健康国际研讨会”的基础上,将与郑州轻工业大学、河南农业大学、河南工业大学、河南科技学院、许昌学院于 2022年12月3-4日 在河南郑州共同举办“2022年动物源食品科学与人类健康国际研讨会”。欢迎相关专家、学者、企业家参加此次国际研讨会。

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