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蛋白纳米孔揭示了肾素-血管紧张素系统中酶的串扰效应
肾素-血管紧张素系统（RAS）可以保护人体免受血压下降或电解质失衡的影响。该系统的失调会导致心血管疾病。病理性RAS的传统临床疗法主要集中在主效应肽血管紧张素II（Ang II），涉及其形成酶ACE（血管紧张素转换酶）的抑制剂或Ang II受体拮抗剂治疗。事实上，内源性ACE2也可以降低Ang II的水平，并将其前体Ang I降解为Ang 1-9（图1b）。ACE2和ACE的“串扰效应”确实对RAS有复杂的影响，从而可能为RAS的调节机制提供新的深入见解。并且，当细胞被冠状病毒攻击时，ACE和ACE2的串扰被进一步扰乱，导致特征性症状。因此确切需要一种实时定量监测具有微妙差异和短半衰期的多种成分的方法以检测肾素-血管紧张素系统中的串扰效应。
基于以上挑战，南京大学龙亿涛教授课题组报告了一种纳米孔框架，以定量确定血管紧张素转换酶（ACE）和血管紧张素转换酶2（ACE2）之间的隐性串扰效应对RAS的影响。通过开发一个能够解决单氨基酸的工程化气溶胶纳米孔，即使ACE的浓度比ACE2的浓度高30倍以上，ACE也能被ACE2选择性地抑制，以防止血管紧张素I的裂解。作者还展示了SARS-CoV-2的刺突蛋白可以明显抑制ACE2剪切血管紧张素肽的活性，这导致了ACE的松弛和主效应物血管紧张素II积累的概率增加。相关成果以“Protein nanopore reveals the renin–angiotensin system crosstalk with single-amino-acid resolution”为题发表在《Nature Chemistry》上，第一作者为蒋杰副研究员和李孟寅副研究员。
高精度和高效率地读取Ang肽的单氨基酸分辨率
气溶胶具有独特的几何结构，它有一个狭窄（∼1.0纳米）和长（∼10纳米）的通道，为单分子传感提供了一个超密闭的环境。这种封闭的空间导致了对高电荷DNA或同源多肽的检测、识别和辨别的高灵敏度。鉴于Ang肽携带的超低电荷，因此进一步设计了气溶胶，以引入电渗流并加强与目标肽的相互作用（图1a）。实验结果显示T232K气溶胶可以通过直接利用电流来识别混合物中的五种Ang肽——Ang I、Ang 1-9、Ang II、Ang 1-7和Ang III（它们只在一个氨基酸上有区别）（图1b-d）。
图1 使用气溶胶纳米孔区分 ACE 和 ACE2 的 Ang 肽底物
构建纳米孔框架以记录Ang I裂解过程
为了确定ACE和ACE2的肽裂解活性，对构建的T232K纳米孔平台在酶功能环境中对Ang肽的单分子检测进行了评估。结果表明，构建的T232K气溶胶框架明显符合要求，从而使作者能够揭示RAS中的串扰效应的影响。
为了进一步验证检测系统中ACE和ACE2的生物活性，作者检查了ACE或ACE2对Ang I的水解情况。如图2结果表明了Ang I被ACE水解了。此外，在整个水解过程中，只检测到两种阻断，即Ang I和Ang II，表明Ang II是ACE单独从Ang I中得到的唯一分解产物。如图2c所示，通过结合T232K气溶胶中Ang I和Ang II的捕获效率，每分钟计算出Ang I和Ang II的浓度，证明了纳米孔方法的实时性。如图2d所示，根据Lineweaver-Burk图，在纳米孔测量中，ACE对Ang I的k cat和k M是相当的，但明显低于以前研究中发现的。这可能是由于过高浓度的氯化物抑制。同样，在ACE2的水解过程中也观察到Ang 1-9的特征性阻断逐渐出现， Ang 1-9是ACE2产生的Ang I的唯一产物。如图2f-h所示，在实验条件下，ACE2对Ang I的水解效率高于ACE。
图 2：实时监测由 ACE 或 ACE2 介导的 AngI的演变
ACE和ACE2之间的串扰
为了探索ACE和ACE2在RAS中的串扰效应，作者进一步分析了在ACE和ACE2存在下的肽底物转化。如图3a（左图）所示，在肽底物Ang I中加入ACE和ACE2的混合酶后，Ang I的数量明显减少，而对应于其他三种Ang肽的数量则连续增加。接近尾声时，所有的肽几乎完全转化为只有一个物种（图3a）。令人惊讶的是，预计由ACE裂解Ang I产生的Ang II，在整个催化过程中根本没有观察到。为了弄清楚为什么Ang II在反应过程中没有出现，作者每隔1分钟计算一次Ang肽的浓度。如图3c左侧面板所示，从Ang I到Ang 1-9、Ang 1-7和Ang 1-5的逐步转化清楚地表明没有Ang II。更重要的是，如图2f,g所示，Ang I的转化速度与ACE2单独裂解Ang I的反应期间几乎相同，这表明Ang II的缺失不是由ACE2立即降解造成的。考虑到Ang 1-7和Ang 1-5的产生确实需要ACE的协助，这些结果表明ACE的活性被ACE2严重地、有选择地抑制，而ACE2只作用于Ang II的产生（图3d，左）。
图 3：实时监测 ACE2 和 ACE 对 Ang I 的酶促降解
SARS-CoV-2 刺突蛋白的影响
因为SARS-CoV-2的刺突蛋白（SP）与ACE2的N末端区域结合来感染哺乳动物细胞，如图4a所示，SP被用来评估SARS-CoV-2在这个串扰系统中的影响。如图4b所示，SP明显减少了Ang 1-9、Ang 1-7和Ang 1-5的产生，而Ang II的比例增加。这些观察表明，SP的存在可以消耗ACE2，导致基于ACE2的Ang肽裂解减少。由于Ang I向Ang 1-9、Ang 1-7或Ang 1-5的转化只由ACE2介导一次，可以估计SARS-CoV-2的SP对ACE2的抑制。如图4d所示，令人惊讶的是，SP对基于ACE2的裂解量的抑制与反应时间成正比。然而，SP对基于ACE的裂解量的变化与反应时间表现出非单调的相关性（图4e），这可能是由于产生Ang 1-7和Ang 1-5的ACE活性增强，从而抵消了ACE2活性的减弱。
图 4：SARS-CoV-2 的 SP 对 ACE 和 ACE2 之间串扰的影响
小结
总之，作者报道了一个纳米孔框架，可以在复杂的环境中内在地筛选ACE2和ACE之间的串扰效应。通过直接读取酶解过程中多个安氏肽的单个分子，不仅清楚地说明了ACE2对ACE的选择性抑制作用，而且还说明了SARS-CoV-2 SP的影响。结果证明，SARS-CoV-2 SP和ACE2的结合可以削弱ACE和ACE2的串联作用，导致血管收缩和纤维化因子Ang II的积累。SARS-CoV-2对ACE2的这种抑制显示了纳米孔框架的另一个明显优势，它可以克服其他单分子方法中涉及的额外修饰所引起的不可避免的酶过程的扰动。更有趣的是，在SP的浓度仍然远远高于基于结合亲和力的ACE2的情况下，在没有ACE或ACE2浓度增加的反应中，观察到SP对ACE2的这种抑制的促进作用，这表明它们之间存在复杂的机制。鉴于纳米孔单分子界面的灵敏度和效率可以精确调节，而且研究反应时纳米孔的时间分辨率可以通过开发更智能的算法和/或捕获效率更高的纳米孔传感器来提高，原则上，纳米孔框架可以适用于所有的生物串联效应，甚至可以用于开发单分子时间全局学，揭示未知的生物过程。
作者简介
龙亿涛，博士，南京大学生命分析化学国家重点实验室教授，国家杰出青年基金获得者，教育部长江学者。1989年本科毕业于山东大学，在南京大学获得硕士 (1996年) 、博士 (1998年) 学位。1999-2001年在德国Heidelberg大学进行博士后工作，其后分别在法国国立高等巴黎化学学院 (ENSCP)、加拿大Saskatchewan和Alberta大学、美国加州大学伯克利分校进行研究工作。
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来源：高分子科学前沿
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